微生物實驗步驟怎麼寫

1、準備工作，培養基的配製及滅菌（121-126度滅30分鐘高壓蒸汽式滅菌），玻璃器皿的滅菌（170度滅2小時乾熱滅菌，也可用濕熱滅菌）若量大可加長滅菌時間。

2、微生物實驗室及無菌操作枱開紫外燈滅菌1小時，關閉後至少半小時才進入無菌室，我們一般1小時後才進去。因為紫外燈照射後有殘留。

3、進入無菌室要穿戴專門的衣服，帽子，鞋子，口罩，手套。在接觸無菌的東西都要用75%的酒精噴灑或塗抹，如果是藥品就要求更嚴。

4、實驗完後，把平皿倒置放入設定好温度的培養箱內，並在要的時間觀察記錄。

5、完後無菌室可以打開通風，不然裏面的酒精味很難聞！

6、實驗沒有用完的樣品扔了就行了！不過觀察後有長菌的培養基最好燒開在倒，平皿最好煮一下。

參考資料來源：百度百科-微生物實驗室

熱源，待自然冷卻，壓力恢復至零，温度降到 60 ℃以下 再開蓋取物，以防突然減壓液 體劇烈沸騰或容器爆破。

（3） 卧式壓力鍋蒸氣滅菌器的使用按下列步驟進行： ① 關緊鍋門，打開進氣閥，將蒸氣引入夾層進行預熱，夾層內冷空氣經阻氣器自動 排出。 ② 夾層達到預定温度後，打開鍋室進氣閥，將蒸氣引入鍋室，鍋室內冷空氣經鍋室 阻氣器自動排出。

③ 待鍋室達到規定的壓力與温度時，調節進氣閥，使保持恆定至 ④ 自然或人工降温至 60 ℃再開門取物，不得使用快速排出蒸氣法，以防突然降壓， 液體劇烈沸騰或容器爆破。 ⑤ 使用自動程序控制式壓力蒸氣滅菌器，在放好物品關緊門後，應根據物品類別按 動相應開關， 以便按要求程序自動進行滅菌， 滅菌時必須利用附設儀表記錄温度與時間以 備查，操作要求應嚴格按照廠家説明書進行。

5 .滅菌温度與時間 （1） 乾熱滅菌器滅菌温度 160 ℃， 1.5-2h 。 (2) 壓力蒸氣滅菌 鍋滅菌温度與時間 （二）間歇滅菌方法 1. 滅菌方法系利用不加壓力的蒸氣滅菌，某些物質經高壓蒸氣滅菌容易破壞，可用此 法滅菌。

（ 1 ）將欲滅菌物品置於鍋內，蓋上頂蓋，打開排水口，使器內餘水排盡。 （ 2 ）關閉排水口，打開進氣門，根據需要消毒 10 ~ 20min 。

( 3 )滅菌完畢關閉進氣門，取出物品待冷至室温温度，放入 37 ℃温箱過夜，次日仍 按上述方法消毒，如此三次，即可達到滅菌目的。 2 .血清凝固器使用方法，培養基中含有血清或雞蛋特殊成份時，因高熱會破壞其營 養成份，故用低温，可使血清凝固，又可達到滅菌目的。

（1） 在使用該法滅菌的血清等分裝時，需嚴格遵守無菌操作，試管、平皿也經滅菌後 使用。 （2） 將培養基按要求使成斜面或高層， 加足水後， 接上電源， 升温 75 ~ 90 ℃ 1h 滅菌， 放 37 ℃温箱過夜，再如此滅菌三次。

3 .煮沸消毒：可用煮鍋或煮沸消毒器，水沸騰後再煮 5 ~ 15 min ，也可在水中加入 2 ﹪石炭酸煮沸 5 min ，加入 0.02 ﹪甲醛 ， 80 ℃煮 60 min 均可達到滅菌目的 ， 但選用 煮沸消毒的增消劑時 ， 應注意對物品的腐蝕性 . 4 .滅菌處理 ： 滅菌後物品 ， 按正常情況已屬無菌 ， 從滅菌器中取出應仔細檢查放置 ， 以免 再度污染。 （1） 物品取出 ， 隨即檢查包裝的完整性 ， 若有破壞或棉塞脱掉 ， 不可作為無菌物品使用。

（2） 取出的物品 ， 如為包裝有明顯的水浸者 ， 不可作為無菌物品使用。 （3） 培養基或試劑等 ， 應檢查是否符合達到滅菌後的色澤或狀態 ， 未達到者應廢棄。

（4） 啟閉式容器 ， 在取出時應將篩孔關閉。 （5） 取出的物品掉落在地或誤放不潔這處 ， 或沾有水液 ， 均視為受到污染 ， 不可作為無 菌物品使用。

（6） 取出的合格滅菌物品 ， 應存放於貯藏室或防塵櫃內 ， 嚴禁與未滅菌物品混放。 （7） 凡屬合格物品 ， 應標有滅菌日期及有效期限。

（8） 每批滅菌處理完成後 ， 記錄滅菌品名、數量、温度、時間、操作者。 四、有毒有菌污物處理要求 微生物實驗所用實驗器材、培養物等未經消毒處理，一律不得帶出實驗室。

1. 經培養的污染材料及廢棄物應放在嚴密的容器或鐵絲筐內，並集中存放在指定地 點，待統一進行高壓滅菌。 2. 經微生物污染的培養物，必須經 121 ℃ 30min 高壓滅菌。

3. 染菌後的吸管，使用後放入 5 ﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡 24h （消毒 液體不得低於浸泡的高度）再經 121 ℃ 30 min 高壓滅菌。 4. 塗片染色沖洗片的液體，一般可直接衝入下水道，烈性菌的沖洗液必須衝在燒杯 中，經高壓滅菌後方可倒入下水道，染色的玻片放入 5 ﹪煤酚皂溶液中浸泡 24 h 後，煮 沸洗滌。

做凝集試驗用的玻片或平皿，必須高壓滅菌後洗滌。 5. 打碎的培養物， 立即用 5 ﹪煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位， 浸泡半 小時後再擦拭乾淨。

污染的工作服或進行烈性試驗所穿的工作服、帽、口罩等，應放入專用消毒袋內，經 高壓滅菌後方能洗滌。 五、培養基製備要求 培養基製備的質量將直接影響微生物生長。

因為各種微生物對其營養要求不完全相同， 培養目的的不同，各種培養基製備要求如下： 1 .根據培養基配方的成分按量稱取，然後溶於蒸餾水中，在使用前對應用的試劑藥 品應進行質量檢驗。 2 . PH 測定及調節： PH 測定要在培養基冷至室温時進行，因在熱或冷的情況下， 其 PH 有一定差異，當測定好時，按計算量加入鹼或酸混勻後，應再測試一次。

培養基 PH 值一定要準確， 否則會影響微生物的生長或影響結果的觀察。 但需注意因高壓滅菌可 影響一些培養基的 PH 降低或升高，故不宜滅菌壓力過高或次數太多，以免影響培養基 的質量，指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等一般在調完 PH 後再加入。

3 .培養基需保持澄清，便於觀察細菌的生長情況，培養基加熱煮沸後，可用脱脂棉 花或絨布過濾，以除去沉澱物，必要時可用雞蛋白澄清處理，所用瓊脂條要預先洗淨晾乾 後使用，避免因瓊脂含雜質而影響透明度。 4 .盛裝培養基不宜用鐵、銅等容器，使用洗淨的中性硬質玻璃容器為好。

5 .培養基的滅菌既要達到完全滅菌目的，又要注意不因加熱而降低其營養。

大多數細菌可在蛋白腖牛肉膏培養中生長，就是蛋白腖牛肉膏培養基為例實驗步驟如下：

1、培養皿用報紙包起來，滅菌

2、配製培養基，培養基完全溶於水後，調PH值7.2-7.4之間。

3、配製好並調完PH值的培養基中，按1.5%的比例加入瓊脂粉。（教材上寫要加熱溶解後再滅菌，根據工作經驗，加入培養基中，直接滅菌，高温狀態下，瓊脂自然就溶解了）

4、滅菌後的培養基倒入平板中，瓊脂凝固後，倒置。

5、接種環在酒精燈的火焰上燒紅後，降温，取一環菌，在平板上劃線。

6、劃線後的平板，倒置放入培養箱中培養。

7、培養24小時後，觀察菌苔形態、菌生長情況。

以上是我工作的步驟，可能與書上有出入，因工作時間長了，有些細節就不太注意了。還是要以微生物實驗書以主。

標本製作：

製作顯微鏡標本，分一下6大步驟，可以供初學者進行參考：

1.取載玻片與蓋玻片各一片，用軟布擦乾淨，由於蓋撥片很薄，擦時要小心，可用左手拇指和食指夾住蓋玻片邊緣，把紗布平鋪在右手手掌上，從上下兩面輕輕夾住蓋玻片，平均使用力量慢慢輕擦，這樣才不會把蓋玻片擦碎。

2.用滴管吸取1~2滴清水，放在載玻片中央。

3.用鑷子撕取觀察物體一小片（無論觀察細胞組織或器官，材料必須做成薄片，才能觀察，這些薄片不能過厚，一般一層細胞的厚度為好，如果過厚不但細胞互相重疊，而且光線不易穿透，雖然在顯微鏡下能勉強看到輪廓，但細緻的結構很難看清），置於載玻片上的小水滴中，儘量勿使材料皺縮。

4.用鑷子夾取一片乾淨的蓋玻片，先以蓋玻片的一邊斜着與小水滴接觸，然後便慢慢放下蓋玻片，將觀察材料全部蓋上，操作時，防止蓋玻片驟然下降，以免發生氣泡，妨礙觀察效果。

5.製作好的玻片，要求蓋玻片與載玻片之間恰好被水分充滿；當水分不足時，可用滴管從蓋玻片一側的邊緣滴少許水分，在另一側用吸水紙吸，從而使蓋玻片與載玻片之間被水分充滿；當水分多餘時，可用吸水紙吸去多餘水分。

6、染色：用滴管從蓋玻片一側的邊緣滴少許碘液，在另一側用吸水紙吸，從而使蓋玻片與載玻片之間被碘液充滿；當碘液多餘時，可用吸水紙吸去多餘碘液。 製作好後就可以放到顯微鏡下面觀察了。

一、目的要求

學習平板菌落計數的基本原理和方法。

二、基本原理

平板菌落計數法是根據微生物在固體培養基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的現象進行的，也就是説一個菌落即代表一個單細胞。計數時，先將待測樣品作一系列稀釋，再取一定量的稀釋菌液接種到培養皿中，使其均勻分佈於平皿中的培養基內，經培養後，由單個細胞生長繁殖形成菌落，統計菌落數目，即可換算出樣品中的含菌數。

這種計數法的優點是能測出樣品中的活菌數。此法常用於某些成品檢定（如殺蟲菌劑），生物製品檢定以及食品、水源的污染程度的檢定等。但平板菌落計數法的手續較繁，而且測定值常受各種因素的影響。

三、器材

大腸桿菌懸液，牛肉膏蛋白腖培養基， 1ml無菌吸管，無菌平皿，盛有4. 5 ml無菌水的試管，試管架和記號筆等。

四、操作步驟

1.編號：

取無菌平皿 9套，分別用記號筆標明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有4.5ml無菌水的試管，排列於試管架上，依次標明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

2.稀釋

用1ml無菌吸管精確地吸取0.5ml大腸桿菌懸液放入10-1的試管中，注意吸管尖端不要碰到液麪，以免吹出時，管內液體外溢。然後仍用此吸管將管內懸液來回吸吹三次，吸時伸入管底，吹時離開水面，使其混合均勻。另取一支吸管自10-1試管吸0.5ml放入10-2試管中，吸吹三次，……其餘依次類推。整個稀釋過程如圖Ⅷ-3。

3.取樣

用3支1ml無菌吸管分別精確地吸取10-4、10-5、10-6的稀釋菌液0.2ml，對號放入編好號的無菌培養皿中。

4.倒平板

於上述盛有不同稀釋度菌液的培養皿中，倒入溶化後冷卻至℃左右的肉膏蛋白腖瓊脂培養基約10—15ml，置水平位置，迅速旋動混勻，待凝固後，倒置於37℃温室中培養。

5.計數

培養24小時後，取出培養皿，算出同一稀釋度三個平皿上的菌落平均數，並按下列公式進行計算：

每毫升中總活菌數=同一稀釋度三次重複的菌落平均數*稀釋倍數*5

一般選擇每個平板上長有30—300個菌落的稀釋度計算每毫升的菌數最為合適。同一稀釋度的三個重複的菌數不能相差很懸殊。由10-4、10-5、10-6三個稀釋度計算出的每毫升菌液中總活菌數也不能相差懸殊，如相差較大，表示試驗不精確。

平板菌落計數法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的，一般以三個稀釋度中的第二稀釋度倒平板所出現的平均菌落數在50個左右為最好。

平板菌蓓計數法的操作除上述的以外，還可用塗布平板的方法進行。二者操作基本相同，所不同的是塗布平板法是先將牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基溶化後倒平板，待凝固後編號，並於 37℃温室中烘烤30分鐘左右，使其乾燥，然後用無菌吸管吸取 0.2ml菌液對號接種於不同稀釋度編號的培養皿中的培養基上，再用無菌玻璃刮棒將菌液在平板上塗布均勻，平放於實驗台上20—30分鐘，使菌液滲透入培養基內，然後再倒置於37℃的温室中培養。

五、實驗報告

1.結果

將計數結果填入下表。

2.思考題

(1)為什麼溶化後的培養基要冷卻至45℃左右才能倒平板？

(2)要使平板菌落計數準確，需要掌握哪幾個關鍵？為什麼？

(3)同一種菌液用血球計數板和平板菌落計數法同時計數，所得結果是否一樣？為什麼？

(4)試比較平板菌落計數法和顯微鏡下直接計數法的優缺點。

一片白？全是菌落嗎？如果是的話就是你塗平板時用的菌液太濃導致菌落和菌落之間無法分開，連成一片。另外，塗布時用的塗布棒或是接種環在灼燒後應接觸培養皿上蓋內側一會兒，在降温後在去接觸菌液，不然容易燙死細菌。

服了你，我敢肯定你取樣後肯定就直接將樣品全倒到培養基上了，這是不正確的，樣品必須進過稀釋，否則菌落密度很高，連成一片。

1.首先，你得根據你所要的細菌設計一培養基，儘可能使得只有你要的這一細菌能在培養基上生存，如果不考慮細菌的種類，只考慮他們的數量的話，則可以用全營養培養基。

2.然後算樣品液的總體積，從中取1ml出來放進一滅菌試管中，加液體培養基9ml，搖勻，此時菌液被稀釋10倍。再從這一試管中取1ml液體加入另一無菌試管中，在往這新的試管中加入液體培養基9ml，此時新試管中的菌液被稀釋了100倍，重複，下去，直到被稀釋100000倍後為止。

3.接着將上述試管中的菌液各取1ml注入到固體培養基上（此時又相當於在各試管稀釋的基礎上又稀釋了10倍），用滅菌塗布棒塗布均勻，進行培養。

最後，找出菌落分散較好的培養基，計數菌落，然後乘以稀釋倍數（要包括步驟3中的那10倍）再乘以你得樣品的總體積數，從而得出細菌總數。

注意：以上操作必須在無菌條件下進行。

實驗原理： 從複雜的微生物羣體中獲得只含有一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。

常用的方法有1、簡單單細胞挑取法 2、平板分離法此次實驗採取的是平板分離法，該方法操作簡單，普遍用於微生物的分離與純化。其原理包括兩方面：1、在適合於待分離微生物的生長條件（如營養、酸鹼度、温度與氧等）下培養微生物，或加入某種抑制劑造成只利於待分離微生物的生長，而抑制其他微生物生長的環境，從而淘汰一些不需要的微生物。

2、微生物在固體培養基上生長形成的單個菌落可以是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得純培養。

獲得單菌落的方法可通過稀釋塗布平板或平板劃線等方法完成。 但是從微生物羣體中經分離生長在平板上的單個菌落並不一定保證是純培養。

因此，純培養的確定除觀察其菌落的特徵外，還要結合顯微鏡檢測個體形態特徵後才能確定。有的微生物的純培養要經過一系列分離與純化過程和多種特徵鑑定才能得到。

土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，是發掘微生物資源的重要基地，可以從中分離純化的到許多有價值的菌株。

此實驗將從土壤中分離兩種細菌。實驗器材、試劑與菌種：1、器材：培養皿、載玻片、蓋玻片、普通光學顯微鏡、量筒、滴管、吸水紙、燒杯、三角瓶、電爐、玻璃棒、接種環、鑷子、搪瓷杯、恆温培養箱、高温滅菌鍋、移液槍（槍頭）、電子天平、濾紙、pH試紙等。

2、試劑：配製牛肉膏蛋白腖培養基的原料（牛肉膏、NaCl、瓊脂、蛋白腖）、配置糖發酵培養基的原料（葡萄糖、K2HPO3、溴百里酚藍、瓊脂、NaCl、蛋白腖）、甘油（丙三醇）、結晶紫染液、番紅染液、碘液、95%乙醇、5%孔雀綠染液、0.5%番紅水染液、3%過氧化氫水溶液、1%鹽酸二甲基對苯撐二胺溶液、蒸餾水等。3、土樣：取自山東大學7號宿舍樓門前土壤，地下10cm左右。

實驗步驟：1、配製牛肉膏蛋白腖培養基：1）配製牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基500ml （用於12個平皿和10支試管斜面） 牛肉膏 0.3% ………………………………… 1.5 g 蛋白腖 1% …………………………………… 5g NaCl 0.5% ………………………………… 2.5g 瓊脂 2% …………………………………… 10g pH ………………………………………… 7.0~7.2 2）倒12個平板和10支試管斜面，包紮，121℃滅菌20min.2、製備土壤稀釋液：稱取土樣10g，放入盛有100ml無菌水的帶有玻璃珠的三角瓶中，振盪搖勻10min 使土和水充分混合，然後用移液槍從三角瓶中吸取1ml（此操作要求無菌操作），加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推分別製成製成0.01、0.001、0.0001不同稀釋度的土壤溶液。3、塗布培養：以0.01以及0.0001兩個濃度的土壤稀釋液作為塗布平板培養的對象，將其分別塗布在3個牛肉膏蛋白腖培養基中，共6個培養基，標號，37°C温箱培養48 h。

4、劃線分離（劃線培養）：對兩種土壤溶液的微生物培養基進行觀察，記錄兩種區分明顯的細菌性狀。挑取此兩種細菌在新的培養基中劃線培養（每種細菌培養3個培養皿），標號、37°C培養。

5、初步鑑定：對兩種菌進行簡單染色、革蘭氏染色以及芽孢染色觀察，記錄結果。6、試管斜面再培養： 將兩種純菌株接種分別接種在5支試管中，共10支試管。

37°C培養（18-24h）。7、對試管中培養的兩種菌進行生理生化鑑定： 1）過氧化氫酶鑑定： A 實驗原理：乳酸菌與許多厭氧菌與其他細菌區分的主要依據是鑑定有無過氧化氫酶。

該酶可以把過氧化氫分解為水與氧氣，氣體氧以氣泡跑出來，則為過氧化氫酶實驗陽性。乳酸菌和許多厭氧菌在過氧化氫酶實驗中呈現陰性。

B 步驟：將培養新鮮的待測菌種（培養18-24h內）接在載玻片上，滴一滴3%過氧化氫於菌體上。 2）糖發酵與氧化實驗 A 實驗原理：在細菌的分類鑑定中，糖發酵與氧化測定是一項重要的依據。

絕大多數細菌都可以利用糖類作為能源以及碳源，但由於不同的菌存在酶系的差異，因而對糖類的發酵與氧化的能力就有所不同。有的在糖類發酵與氧化代謝中能分解糖類，產酸產氣，有的則只能產酸不可以產氣。

酸的產生與否，以及是發酵型產酸還是氧化型產酸，可以由預先加在培養基中的指示劑（溴百里酚藍水溶液）呈現出來。這樣把接好菌種的培養基放在厭氧或好氧的環境下培養，培養基有綠色變為黃色為產酸，是否產氣是通過觀察培養基中是否產生氣泡或培養基斷裂來測定。

B 步驟 ① 配置糖發酵培養基150 ml （葡萄糖：、K2HPO3：、溴百里酚藍、瓊脂：、NaCl：、蛋白腖：），分裝試管。 ② 110°C滅菌培養基20 mins （同時滅菌一定量甘油，待用）。

③ 對兩種細菌進行“穿刺”培養，每種菌做5個試管：2個蓋管培養，2個開管培養，一個為蓋管對照組。在培養基的上方加入1-2cm厚的甘油，作為“蓋 管”，以提供菌體無氧的生長環境，開管則不加甘油，作為有氧的生長環境供菌體生長。

④ 在37°C下培養，並在培養24h後觀察培養基中顏色的變化，以及有無氣泡。 3）細胞色素氧化酶測定 A 實驗原理 細胞色素氧化。