1、無毒和無菌是體外培養細胞的首要條件。細胞在活體內，解毒系統和免疫系統可抵抗微生物或其他有害物質的入侵，但細胞在體外培養的過程中，缺乏機體免疫系統的保護而喪失對微生物的防禦能力和對有害物質的解毒能力。為保證細胞能在體外環境中生長繁殖，必須要確保無菌工作區域、良好的個人衞生、無菌試劑和培養基以及無菌操作。
2、常見的微生物污染有支原體、細菌、真菌。支原體無致死毒性，可與細胞長期共存，對細胞有潛在影響，但體積小，不易鑑別，可藉助於地衣紅或Hoechst33342染色來進行檢測。細菌增殖快，在短時間內即可大量擴增，併產生毒素殺死細胞。真菌的種類繁多，肉眼可見，漂浮於培養液麪上，可呈絲狀、管狀或樹枝狀等。
3、一般哺乳類與禽類細胞在體外培養的適宜温度是37～38℃，不適宜的環境温度會影響細胞的生長。細胞對低温的耐受能力要強於對高温的耐受能力，在低温下，細胞的代謝活力及核分裂能力降低。若温度不低於0℃，雖然細胞代謝受到影響，但無損傷作用；25～35℃時，細胞以緩慢的速度生長；但若被置於40℃數小時，則不僅不利於細胞生存、生長，甚至可導致其死亡。
4、高滲溶液或低滲溶液會引起細胞發生褶皺、腫脹、破裂。因此，滲透壓是體外培養細胞的重要條件之一。多數體外培養的細胞對滲透壓都有一定的耐受能力，實際應用中，260～320mmol/L的滲透壓可適用於大多數細胞。
5、細胞的體外培養需要理想的氣體環境，氧氣、二氧化碳是細胞生存的必要條件。氧氣參與細胞的三羧酸循環，為細胞生存、代謝與合成提供能量；二氧化碳既是細胞的代謝產物，是細胞生長的必需成分，又與維持培養液的pH有關。大多數細胞適宜的pH範圍往往是7.2～7.4。在開放式培養中，以5%的二氧化碳氣體比例為宜。
